Appelé "Peter-Three" par ses alliés, le jeune héros d'un univers alternatif assume son rôle de frère du milieu au sein du trio composé de différentes versions de lui-même dans un autre monde. Prêt à aider sa version plus jeune et sa version légèrement plus âgée à affronter deux de ses plus grands adversaires, ainsi que d'autres ennemis qui lui sont encore inconnus, afin qu'ils puissent retourner chacun dans leur propre univers, il est toujours hanté par son échec à sauver sa petite amie décédée, Gwen Stacy. Il a développé ses web-shooters synthétiques en utilisant la technologie Biocable de l'Oscorp de son monde et utilise un costume rouge et bleu divisé par des lignes noires, et un masque avec de grands yeux comme visières pour protéger son identité. Sur un piédestal formé de bois et de structures métalliques provenant d'un échafaudage sur Liberty Island à New York, l'étonnant grimpeur de murs se prépare les bras ouverts, prêt à l'action.

Événement majeur dans les salles obscures, le film réunit pour la première fois différentes versions du personnage issues d'adaptations distinctes, faisant revenir les acteurs Willem Dafoe (Norman Osborn), Alfred Molina (Otto Octavius), Thomas Haden Church (Flint Marko), Rhys Ifans (Dr. Curt Connorts), et Jamie Foxx (Max Dillon) qui reprennent leurs rôles des productions précédentes, tout comme Tobey Maguire et Andrew Garfield dans le rôle du sympathique héros arachnide.